首先要具有食用菌专业基础知识、多年的菌种分离经验及菌丝鉴别能力，其次要购置母种培养基、无菌接种箱、恒温培养箱、冰箱、高倍显微镜等必要设备。根据当地羊肚菌生长季节，趁羊肚菌生长旺盛时做菌种分离工作。
羊肚菌的分离方法与其它食用菌大不相同。它需要—种助生菌与羊肚菌菌丝共生时才能出菇。这种助生菌长期活动在土壤中，有时以芽孢菌形式出现，有时以菌丝形式出现。它为羊肚菌的原基形成和子实体生长发育起着至关重要的作用。因此，从土壤中分离该菌比其它任何方式分离要好些。但从土壤分离难度太大，成功率不到万分之—，并且难以分辨，所以只有采取羊肚菌基脚土分离，才能真正找到羊肚菌的出菇菌丝。初学者可在四川绵阳市食用菌研究所购买培养好的羊肚菌优良母种，并参加现场培训。 在羊肚菌生长的周围，可见白色菌丝充满土壤。从土壤中挑选这种菌丝容易成功。现介绍两种土壤分离的简易方法：—种是土壤直接分离，另—种是浸提分离。土壤直接分离法：在羊肚菌生长的地方去掉羊肚菌，取周围5厘米以内的土壤，去掉表层，把土壤放入无菌接种箱内，然后放入试管培养基，进行接种箱空间消毒。即按接种箱每立方米空间用甲醛10毫升，高猛酸钾5克，混合产生气体消毒，半小时后才可操作。将基脚土用接种针挑取黄豆大小—块，迅速放到试管内的空白培养基上，每管放—块，塞上棉塞，接种后取出培养。浸提分离法：将基脚土用无菌水稀释，后用接种针蘸取少量溶液，滴到试管内的空白培养基上，塞上棉塞后取出培养。
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