WCS、AH及MS均来自满城县同一牛场，饲料制成风干样品粉碎过20目筛，密封保存以备用。经测定3种粗饲料营养成分见表1。 试验选取3头处于泌乳中期、健康状况良好、年龄和体重相近、装有永久性瘤胃瘘管的成年荷斯坦奶牛用作瘤胃液供体动物。日粮组成采用冯仰廉和陆治年主编的《奶牛营养需要和饲料成分》(修订第三版)进行配制。TMR饲喂，每日挤奶3次，活动和饮水。 采用单因子7处理重复试验设计，将WCS与AH干草以100：0，80：20，60：40，50：50，40：60。20：80，0：100的比例进行组合；筛选出WCS与AH的最优组合后再与谷草以这7个比例进行组合，每个组合3个重复。 本试验参照Menke等(1988)注射器式培养系统进行瘤胃体外发酵培养。人工瘤胃装置主体为恒温水浴摇床，玻璃注射器(可计量容积为100 mL，前面带有胶管)作发酵培养管，注射器每次使用之前洗净晾干，然后用少量凡士林涂在活塞筒四周，用来减少摩擦和防止漏气。用前39℃预热。 取400 mL蒸馏水+0.1 mL(A)液+200 mL(B)液+200 mL(C)液+1mL(E)液于具塞玻璃瓶中，持续充人CO2至饱和，置于恒温水浴中预热至39℃待用。临用前加入40 mL还原剂溶液(E)，直至溶液由淡蓝色转变为接近无色。 在早晨饲喂前，将真空泵管经瘤胃瘘管进人瘤胃中，在不同位点采集瘤胃液，灌人经预热达39℃并通有CO2气体的保温瓶中，立即盖严瓶口，迅速返回实验室。将3头牛的瘤胃液混合，经4层纱布过滤于接收瓶中，置于39℃水浴中保存，持续通人CO2气体。 准确称取不同粗饲料比例的饲料样品200 mg，置于不同玻璃注射器的前端，注射器内充入CO2保持厌氧。抽取始终用CO2气体饱和的人工瘤胃液30 mL(瘤胃液：培养液体积比为1：2)，排净注射器中的空气，用夹子夹住胶管，密闭，记录刻度，然后在39℃的恒温水浴摇床中培养72 h。每个样品设3个重复，另设置3个空白样品。以消除试验误差。 将注射器分别培养72 h，发酵过程中记录注射器0、2、4、8、12、18、24、36、48、60、72 h的刻度，计算累计产气量(GP)。72 h发酵结束后，迅速将注射器放人冰水浴中终止发酵。将注射器中的发酵液，经孔径50μm 的尼龙布过滤，测定干物质消失率(DML)、氨态氮(NH2-N)、微生物蛋白(MCP)及挥发性脂肪酸(TVFA)的含量(侯玉洁等，2013)。 式中：GPt为样品在t时刻的产气量，mL；Vt为样品发酵t时刻产气量；V0为空白管t时刻产气量；W0为样品干物质重，g。 经尼龙布过滤的残渣，用蒸馏水冲洗几遍，沉淀物65℃烘干48 h，称重测定DML(侯玉沽等。2013)。 取10 mL滤液，采用靛酚比色法测定发酵液中的NH3-N浓度(当天测完)(冯慈等，1993)。 单项组合效应指数(SFAEI)和多项组合效应指数(MFAEI)参照(2003)所用方法计算。 所有数据采用Excel软件进行初步处理，然后利用SPSS 19.0中的ANOVA程序进行方差分析,差异显著时用Duncans法进行多重比较。试验结果用“平均数±标准差”表示。 WCS与AH体外培养72 h产气量变化曲线，各组随着培养时间的增加，累积产气量均逐渐升高，然后趋于平缓；随着AH比例的增加，GP呈现递减的趋势。72 h时，80：20组合累积GP最高，为230.63 mL，60：40组合为227.49 mL，两者之间差异不显著(P0.05)，80：20极显著高于其他5个组合(P0.01)，它比100：0、50：50、40：60、20：80、0：100组合分别提高了8.84％、7.36％、9.18％ 、12.92、19.40％。单一WCS的产气量比单一AH的产气量高9.71％(P0.01)。
由表3可知，各比例组合间的GP和DML均产生了正组合效应。且两个指标的各比例组合效应的变化规律一致，均在80：20时SFAEI最高；MCP与TVFA均在60：40时SFAEI最大，此后随着AH比例的增加组合效应值逐渐减小，20：80时为负组合效应；NH3-N浓度各比例的SFAEI均为正值，60：40组合SFAEI最大。由MFAEI可以看出，60：40时组合效应值最大，即为WCS与AH的最佳比例。 由表5可知。各比例组合中，80：20，60：40，20：80组合的GP为正组合效应，其他比例组合为负组合效应，60：40出现最大SFAEI，为0.015；50：50组合的DML为负组合效应，其他比例组合为正组合效应，SFAEI最大组合为60：40；80：20组合MCP的SFAEI最大。各比例组合随着MS比例增加，组合效应值逐渐降低，由正值逐渐变为负值；NH3-N组合效应最大值及变化趋势与MCP相同.但从50：50开始已变为负组合效应；TVFA组合效应值变化范围为-0.011～0.106；MFAEI从大到小组合依次为80：20、60：40、50：50、40：60、20：80， 其值分别为0.324、0.178、0.011、-0.035、-0.137，可以得出WCS-AH最优组合与谷草最优搭配比例为80：20。
瘤胃中的气体主要来源于饲料中碳水化合物和蛋白质的发酵，瘤胃发酵的产气量可综合反映饲料的发酵程度。可发酵有机物含量与瘤胃微生物的活性和产气量呈正相关，瘤胃微生物活力也取决于瘤胃能氮平衡程度(孙国强等，2014；史卉玲等，2013)。 不同比例WCS和AH、WCS-AH和MS组合均随着发酵时间的延长产气量逐渐增加，然后趋于平缓。这是由于发酵前期底物逐渐被瘤胃微生物利用，当可降解底物越来越少时，产气量也逐渐减少。当WCS与AH比例为80：20时产气量最大，可能此时能氮平衡的比例最佳，此后随AH比例的增加产气量逐渐下降，可能是因为AH增加，使饲料组合中蛋白质含量增加，可溶性碳水化合物相对减少所致。也有研究表明，与饲料中碳水化合物相比，蛋白质发酵产生的气体较少，产气量主要与碳水化合物的消化程度有关(布同良，2006)。当不同比例WCS-AH最优组合与MS进行组合时，比例为100：0时产气量最高，而后随着MS比例的增加，产气量逐渐减少。原因可能是因为MS中木质素含量较高，而木质素和纤维素之间形成的酯键，使其紧密地镶嵌在一起。阻碍了纤维分解菌的降解能力，产气量越来越少，从而导致随着MS比例的升高组合效应值逐渐由正组合效应变为负组合效应(郝英飞。2007)。 干物质的消失主要是蛋白质、脂肪、纤维素等物质在培养过程中被消化的过程(刘桂瑞等，2008)。DML在一定程度上反映了饲料营养成分在动物体内的降解程度或利用程度。瘤胃微生物活性越强，DML越高，饲料的可利用程度越高。 本试验中WCS和AH组合及其WCS-AH和MS组合干物质降解率与产气量的变化规律一致，这与袁翠林等(2015)、张文璐等(2009)和等(2001)报道的产气量与底物消失率存在高度正相关的结果相一致。WCS与AH组合，所有组合SFAEI均为正值，可能是因为两者组合后提供了足够的氮源和碳源，以及一些必需的矿物质元素，比单一饲料营养成分和结构更加合理，更适合微生物的生长和发酵。WCS-AH与MS组合后，60：40组的SFAEI最大。然后随着MS比例增加，SFAEI降低甚至出现负值，说明适量的MS可以提高组合效应值，过高其组合可发酵程度降低，组合效应值随之减小。 NH3-N是奶牛日粮中蛋白质及非蛋白氮在瘤胃中的分解产物。其浓度不仅受Et粮蛋白质水平影响，还与瘤胃壁的吸收、瘤胃微生物对氨态氮的利用效率、瘤胃食糜的外流速率、碳水化合物特性和能氮速率有关(王雅倩等，2008；冯仰廉，2004)。NH3-N浓度是衡量瘤胃氮代谢的一个重要指标，它综合反映了Et粮中可降解蛋白质数量与瘤胃微生物蛋白质合成状况。NH3-N作为合成微生物蛋白质的重要前提物质，浓度过低会影响微生物蛋白质的合成，过高则表明氨的速度大于微生物的利用和吸收速度，导致氨的浪费(孙国强等，2013)。因此，保持瘤胃液中最适NH3-N浓度是微生物蛋白质合成的首要条件。 Preston等(1995)认为瘤胃液中NH3-N浓度范围在6 20 mg／dL时，瘤胃微生物生长不受。也有研究表明瘤胃中最佳NH3-N浓度为6.3-27.5 mg／dL(Calsamiglia等，2002)。本试验中WCS和AH组合以及WCS—AH和MS组合NH3-N浓度的范围分别为12.41～14.19 mg，dL，10.46-11.55 mg／dL，均在正常范围内。WCS与AH组合，NH3-N浓度及其SFAEI随着AH 比例的增加，呈现先上升后下降的趋势，由于AH干草的蛋白质为WCS的1.84倍左右，弥补了WCS蛋白质的不足，为瘤胃微生物提供了较充足的氮源，在60：40时SFAEI达到最高。而后随着AH比例的增加逐渐下降，可能是因为AH可发酵碳水化合物含量相对较低，可降解氨与可发酵碳水化合物之间比例失衡，导致NH3-N逐渐下降，SFAEI逐渐降低(杨丽，2007)。不同比例WCS-AH与MS组合中。随着MS比例的增加NH3-N浓度及SFAEI逐渐下降，主要原因是MS可降解蛋白质含量较低所致。 MCP是反刍动物重要的氮源，可以满足反刍动物蛋白质需要量的40％ 80％ 。瘤胃MCP的合成关键取决于瘤胃内碳水化合物、氮的利用效率和瘤胃的能氮平衡(马百顺，2008)。许多研究表明，瘤胃氨和能量的不同步会降低微生物生长和微生物蛋白质的合成，从而影响动物生产性能的发挥，所以能氮比适宜，瘤胃微生物蛋白质合成效率会得到较大地提高(史卉玲，2013；Maeng等。1997)。 WCS和AH组合及WCS-AH和MS组合的MCP产量的变化趋势与NH3-N浓度的变化趋势一致，这与袁翠林等(2015)的试验结果一致。WCS和AH组合，MCP与SFAEI均在60：40时最高。说明该组合能量及氨的利用效率最高。WCS-AH和MS组合，80：20组合MCP及SFAEI最高，说明此时瘤胃有利于MCP的生成，然而随着MS比例的增加，逐渐降低。Hoover等(1991)研究认为，日粮中非结构性碳水化合物(NSC)与结构性碳水化合物(SC)比例是影响MCP的重要因素，可能是由于MS比例的增加，造成NSC与SC的比例改变，了微生物蛋白质的合成。 反刍动物瘤胃发酵产生的VFA是其、生长、泌乳、繁殖的主要能源。约占总能量的70％80％。瘤胃发酵产生的VFA主要包括乙酸、丙酸、丁酸，约占总酸的95％。瘤胃中VFA浓度是反映瘤胃中碳水化合物消化率高低和衡量瘤胃微生物活力的重要指标(吕永艳等，2012)。WCS和AH以及WCS-AH和MS分别在60：40、80：20组合总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度及组合效应值最高，说明这两个组合碳水化合物消化率及微生物活力都达到最佳。TVFA最高的组合与MCP最高的组合相同，这与孙丽莎等(2015)的试验结果一致，可能是因为在饲料发酵产生VFA的同时也产生了大量的ATP，而这些ATP可被微生物作为能源用于维持和生长，特别是用于MCP的合成，所以VFA高的组合，MCP也较高。 在本试验条件下，WCS与AH的适宜配比为60：40：WCS、AH和MS三种粗饲料间的适宜搭配比例为48：32：20。 推荐：
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